Rahvusvaheline USA, Prantsusmaa ja Hiina teadlaste meeskond on loonud poolsünteetilise eluvormi. Ehkki modifitseeritud DNA-ga baktereid on juba üritatud saada, paljunesid mikroorganismid halvasti, vajasid erilisi kasvutingimusi ja lõpuks vabanesid nendesse viidud modifikatsioonidest. "Lenta.ru" räägib uuest teosest, mille uurijad on suutnud need probleemid lahendada, olles saanud olendi, mis erineb radikaalselt kogu Maa loomulikust elust.
Hiljuti koosnes kõigi meie planeedi elusorganismide DNA nelja tüüpi nukleotiididest, mis sisaldasid adeniini (A) või tümiini (T) või guaniini (G) või tsütosiini ©. Kümnete või sadade miljonite nukleotiidide stringid moodustavad eraldi kromosoomid. Kromosoomides leiduvad geenid on põhimõtteliselt pikad nukleotiidjärjestused, milles on kodeeritud valkude aminohappelised järjestused. Kolme järjestikuse nukleotiidi (koodon või triplett) kombinatsioon vastab ühele 20 aminohappest. Seega kasutab elu kolmetähelist geneetilist koodi (ATG, CGC ja nii edasi), mis põhineb neljatähelisel tähestikul (A, C, T, G).
Kui organismi rakk vajab valku (polüpeptiidi), lülitatakse sisse seda kodeeriv geen. Viimane on kinnitatud spetsiaalse ensüümi nimega RNA polümeraas, mis transkriptsiooniprotsessi käigus hakkab järgima nukleotiidide järjestust ja looma sellest koopia molekuli kujul, mida nimetatakse messenger RNA-ks (mRNA). RNA on väga sarnane DNA-ga, kuid tümiini asemel sisaldab see uratsiili (U). Pärast seda lahkub mRNA rakutuumast ja läheb ribosoomidesse, kus see toimib retseptina valgu aminohappeahela loomiseks translatsiooni ajal.
Teadlased otsustasid muuta Escherichia coli geneetilist koodi, lisades sellele kaks täiendavat "tähte". Fakt on see, et elusorganismide DNA on kahekordne, see tähendab, et see moodustub kahest ahelast, mis on üksteisega paaritatud täiendavate sidemete abil. Sellised sidemed moodustuvad ühe ahela A-nukleotiidi aluse ja teisest T-nukleotiidi aluse vahel (sarnaselt C ja G vahel). Seetõttu peavad ka kaks uut sünteetilist nukleotiidi suutma üksteist täiendavalt paaritada. Valik langes dNaM ja d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Foto: Rocky Mountaini laborid / NIAID / NIH
Üks paar sünteetilisi nukleotiide sisestati plasmiidi - kaheahelaline ümmargune DNA molekul, mis on võimeline paljunema ülejäänud bakteri genoomist eraldi. Nad asendasid paari komplementaarsed nukleotiidid A ja T, mis olid osa laktoosoperonist - komplekt geene, mis metaboliseerivad laktoosisuhkrut, ja nendega seotud mittekodeerivad DNA järjestused. Sünteetilisi nukleotiide ei kaasatud piirkonda, mida polümeraas kopeerib mRNA-s.
Reklaamvideo:
Miks teadlased otsustasid mitte sisestada sünteetilisi nukleotiide otse geeni, vaid selle kõrvale? Fakt on see, et nii on geeni muutmine nii keeruline, et see funktsionaalseks jääks. Lõppude lõpuks peate selleks siduma saadud uued koodonid mis tahes aminohappega. Selleks on omakorda vaja rakku õpetada tootma erinevat tüüpi transpordi RNA-d (tRNA), mis suudab neid koodoneid ära tunda.
TRNA molekulid täidavad järgmist funktsiooni. Nad, nagu veoautod, kannavad ühes otsas teatud aminohapet, lähenevad ribosoomides olevale mRNA-le ja hakkavad omakorda sobitama teises otsas paiknevate nukleotiidide kolmikut koodoniga. Kui need sobivad, eemaldatakse aminohape ja lisatakse valku. Kui aga sobivat tRNA pole, siis valku ei sünteesita, mis võib rakkude elujõulisust negatiivselt mõjutada. Seetõttu peaksid sünteetiliste nukleotiidide geenidesse viimisega teadlased looma geenid, mis kodeerivad uusi tRNA-sid, mis suudavad ära tunda tehiskodoneid ja kinnitada polüpeptiidile õige aminohappe. Teadlaste ülesanne oli siiski lihtsam. Neil oli vaja tagada, et sünteetiliste nukleotiididega plasmiid paljuneks edukalt ja kanduks edasi tütarorganismidele.
Escherichia coli transformeerimiseks kasutatud plasmiidid
Pilt: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / loodus / keemiaosakond / Scripsi uurimisinstituut
See plasmiid, tähistatud pINF, viidi E. coli. Kuid selle kopeerimiseks on vajalik, et bakteriraku sees oleks palju nukleotiide. Sel eesmärgil sisestati E. coli veel üks plasmiid, pCDF-1b. See sisaldas diatoomi Phaeodactylum tricornutum PtNTT2 geeni, mis kodeerib NTT valku, mis transpordib nukleotiide toitainekeskkonnast rakku.
Siiski seisid teadlased silmitsi paljude raskustega. Esiteks, Phaeodactylum tricornutumi valkudel on toksiline toime E. coli rakule. Kõik sellepärast, et neis on olemas signaalfunktsiooni kandev aminohappejärjestuse fragment. Tänu temale võtab valk vetikarakus õige positsiooni, mille järel järjestus eemaldatakse. E. coli ei suuda seda fragmenti eemaldada, nii et teadlased aitasid teda. Nad suutsid NTT-st eemaldada esimesed 65 aminohapet. See vähendas märkimisväärselt toksilisust, ehkki vähendas ka nukleotiidide transpordikiirust.
Teine probleem oli see, et sünteetilisi nukleotiide hoiti pikka aega plasmiidides ja neid ei asendatud DNA kopeerimisel. Nagu selgus, sõltus nende ohutus sellest, millised nukleotiidid neid ümbritsesid. Selle teadmiseks analüüsisid teadlased erinevaid kombinatsioone, mis olid varjatud 16 plasmiidi. Et mõista, kas sünteetiline nukleotiid oli järjestusest välja langenud, kasutasid teadlased CRISPR / Cas9 tehnoloogiat.
CRISPR / Cas9
Pilt: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 on molekulaarne mehhanism, mis eksisteerib bakterite sees ja võimaldab neil võidelda bakteriofaagidega. Teisisõnu, see tehnoloogia esindab immuunsust viirusnakkuste vastu. CRISPR on DNA spetsiaalsed sektsioonid. Need sisaldavad lühikesi fragmente DNA-viirustest, mis kunagi nakatasid tänapäeva bakterite esivanemaid, kuid said nende sisemise kaitse abil võitu.
Kui bakteriofaag siseneb bakteritesse, kasutatakse neid fragmente mallina molekulide sünteesiks, mida nimetatakse crRNA-ks. Moodustub palju erinevaid RNA ahelaid, need seonduvad Cas9 valguga, mille ülesandeks on viiruse DNA lõikamine. Ta saab seda teha alles siis, kui crRNA leiab viiruse DNA täiendava fragmendi.
Kui crRNA asemel kasutatakse plasmiidi teatud fragmendiga komplementaarset RNA järjestust, siis lõikab Cas9 ka plasmiidi. Kuid kui selles fragmendis on sünteetilisi nukleotiide, siis valk ei toimi. Seega on CRISPR-i abil võimalik eraldada need plasmiidid, mis on resistentsed soovimatute mutatsioonide suhtes. Selgus, et 13-st 16-st plasmiidist oli sünteetiliste nukleotiidide kadu tähtsusetu.
Seega õnnestus teadlastel luua organism, millel on põhimõttelised muutused DNA-s, mis suudaks neid piiramatus koguses enda sees hoida.
Kuigi poolsünteetilise eluvormi genoomis on ainult kaks ebaloomulikku nukleotiidi, mida koodonites ei leidu ja mis ei ole seotud aminohapete kodeerimisega, on see esimene resistentne organism, mille DNA tähestik koosneb kuuest tähest. Tulevikus saavad teadlased tõenäoliselt kasutada seda uuendust valkude sünteesimiseks, luues seeläbi täieõigusliku kunstliku geneetilise koodi.
Aleksander Enikeev
