Muumiate kudede proovid nimede "Maria" ja "Vavita" all saadeti Peruusse Venemaa laborisse uurimiseks. Esitatud bioloogiliste kudede proove uuriti skaneeriva elektronmikroskoopia, Ramani spektrite, ICPE abil, uuriti kobediatomiidi (aine muumiate naha pinnal) koostist. Samuti viidi läbi ülekantud kudede DNA uuring.
Proovi ettevalmistamine
500 μg koeproovid viidi plasttorudesse ja lahustati 1 ml puhvris (10 mM Tris-HCl, pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Saadud suspensioonidele lisati 0,5% Na dodetsüülsulfaati, kuumutati temperatuurini +80 ° C ja 10 minuti pärast viidi proteinaas K (kuni 500 μg / ml) 24 tunniks termostaadile (+55 ° C).
Deproteiniseerimine viidi läbi fenoolsel meetodil: suspensioonile lisati võrdses mahus fenooli, seejärel fenool: kloroform (1: 1), kloroform; pärast iga lisamist segati pidevalt nurkrootoril ja tsentrifuugiti kiirusel 15 tuhat pööret minutis, 10 minutit.
Pärast kolmandat tsentrifuugimist saadud supersetetele lisati 1/10 osa 1 M NaCl mahust ja 2,5 mahuosa kaks korda destilleeritud etüülalkoholi ning jäeti öö läbi temperatuurile -30 ° C koonilistesse katseklaasidesse - "Eppendorf". Tsentrifuugimine viidi läbi mahuga 15 tuhat. min 10 minuti jooksul ja saadud DNA "sadestus" pruuni sademena. DNA sadet pesti kaks korda 70% etüülalkoholiga, kuivatati toatemperatuuril (1 tund) ja lahustati seejärel TE puhvris.
PCR viidi läbi programmeeritaval termotsüklil "My Cycler" ("Bio = Rad"), kasutades tahkefaasilisel meetodil sünteesitud standardseid oligoprimeere ühingus "Beagler" (Peterburi). Amplifitseerimiseks mõeldud reaktsioonisegu mahuga 25 μL sisaldas: 15 nM iga oligoprimeeri, 67 mM Tris-HCI, pH = 8,8, temperatuuril +25 ° C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 merkaptoetanooli, 170 μg / ml BSA-d ja nelja aluselise dNTP segu seguga kontsentratsioonis 1,0 mM ja termostabiilset DNA polümeraasi Thermus thermophilis (5 Ü / μl) (NPO SibEnzim). Pärast denatureerimist (10 minutit, 94 ° C) viidi iga katsesüsteemi jaoks läbi 35 amplifikatsioonitsüklit: 94 ° C -1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Spetsiifilisuse kontrollimiseks viidi reaktsiooni uuritud lookuste teadaolevate genotüüpidega DNA-proovid (markerisüsteemid), samuti kontrollproovid.mis sisaldavad reagentide segu ilma DNAta. Pärast amplifikatsiooni lisati reaktsioonisegu alikvootidele (7 μl) värvimispuhver ja eraldati vertikaalse elektroforeesiga 6% polüakrüülamiidi geelis (210x150x1 mm), värviti etiidiumbromiidiga ja pildistati ultraviolettvalguses. Alleelide tuvastamiseks kasutati neile lookustele vastavaid alleelistandardeid ("redelid").
Reklaamvideo:
DNA analüüs
Uuringus kasutasime inimese DNA eksomeenianalüüsi meetodit, mis põhineb suure jõudlusega järjestamisel hübridisatsiooni teel rikastamisega.
Inimese DNA eksomeenanalüüsi tehnika.
Analüüsiti 2 proovi … Kõik proovide ettevalmistamise etapid enne PCR-i viidi läbi puhastesse ruumidesse. Proovi ettevalmistamine, DNA ekstraheerimine ja üksikute DNA fragmentide amplifitseerimine viidi läbi erinevates ruumides.
Spetsiifilised adapterid (KAPA raamatukogu ettevalmistamise komplekt ja SeqCap adapterikomplekt; Roche) ligeeriti genoomse fragmenteeritud DNA otstesse (~ 5 ng), misjärel viidi läbi kaheastmeline fragmentide valik pikkusega 200-350 aluspaari, kasutades AMPureXP Beads (Beckman Coulter). … Saadud fragmente amplifitseeriti adapterispetsiifiliste praimeritega ja hübridiseeriti biotinüleeritud spetsiifiliste proovidega (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) 28 tundi 47 ° C juures. Ühes reaktsioonis ühendati kaks DNA proovi. Biotinüleeritud sondi-DNA hübriidid eraldati ja puhastati streptovidiiniga konjugeeritud magnetiliste osakestega, saadud DNA raamatukogu teine amplifikatsioon ja kvalitatiivne hindamine viidi läbi (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Sihtmärgiväliste amplifikatsioonifragmentide ja adapteri dimeeride eemaldamiseks puhastati DNA raamatukogu uuesti, kasutades AMPureXP Beads magnetilisi osakesi (joonis 1). Valmistatud raamatukogu lõplikku kontsentratsiooni hinnati Quantuse seadmel, kasutades kaubanduslikku QuantiFluor® dsDNA System komplekti (Promega). Saadud DNA raamatukogu immobiliseeriti vooluraku pinnale. Sekveneerimine viidi läbi Illumina platvormil, kasutades Standard Flow Cell ja MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 tsüklit). Saadud DNA raamatukogu immobiliseeriti vooluraku pinnale. Sekveneerimine viidi läbi Illumina platvormil, kasutades Standard Flow Cell ja MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 tsüklit). Saadud DNA raamatukogu immobiliseeriti vooluraku pinnale. Sekveneerimine viidi läbi Illumina platvormil, kasutades Standard Flow Cell ja MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 x 150 tsüklit).
Joonis: 1
Sekveneeritud DNA kvaliteedi üldhinnang
Kvaliteedi esmasel hindamisel kasutati selliseid standardmeetodeid nagu FastQC ning programmid Meduusid ja KraTER. Kvaliteedi hindamine ei näidanud, et mõlema proovi sekveneeritud DNA-ga oleks kvaliteediprobleeme. Pilte ei näidata, kuna need pole informatiivsed.
Esimese proovi (täiendavalt M, suure muumia "Maria") jaoks järjestati 113,4M lugemised, teise proovi (edaspidi W, väike memme "WaWita") jaoks sekveneeriti 22,9M lugemised.
Järgmine samm oli järjestatud lugemiste puhastamine erinevatest tehnilistest järjestustest, mis segaksid edasist analüüsi. Selleks kasutati programmi Cookiecutter. Pärast puhastamist oli M ja W jaoks 113,3 M (99%) ja 22,8 M (99%).
Muistse DNA koguse ja selle eraldatus tänapäevast
Muistse DNA olemasolu ja koguse hindamise standardmeetodiks on ajaliselt kahjustatud nukleotiidide hulga hindamine. Selleks kasutati programmi MapDamage 2.0. MapDamage 2.0, mis näitas iidse DNA kogust 30,1%, kuid kuna MapDamage viitab sellele, et me kasutame tihedat viidet ja me ei tea täpselt, kui lähedased mõlemad proovid on tänapäevaste inimeste genoomile, ja kasutasime eksome teeki, siis seda meetodit ise ei olnud piisav. Veel üks hea meetod iidse DNA hindamiseks on lühikeste fragmentide arv.
Väidetava iidse DNA filtreerimine toimus kolmes etapis. Esimeses etapis eemaldasime kõik paarislugemid, mida ei saa ületada, ja ühendada ülekattega ühte paarimata lugemiseks. Need read näitasid, et algne fragment, mis sekveneeriti, oli pikem kui 300 aluspaari. ja tõenäoliselt kaasaegne DNA. Nii et pärast seda sammu jäi vastavalt 86,9% ja 91,8%. Pärast seda valiti üksikud kattuvad fragmendid nii, et nende pikkus oleks lühem kui 150 aluspaari, kuna seda pikkust me iidse DNA jaoks eeldasime. Pärast seda sammu jäi proovide M ja W puhul vastavalt 8,6% ja 38,5%. Tuleb märkida, et vaatamata protsendierinevusele on proovide M ja W absoluutne lugemiste arv väga sarnane: 9,8M ja 8,8M, mida saab seletada asjaoluga, et iidse DNA sisaldus mõlemas proovis on sarnane.
| Parameeter | Näide M (Maria) | Proov W (Wawita) |
| Lugemiste arv | 113,3M | 22,8M |
| Lühikeste fragmentide protsent alla 300 aluspaari | 86,9% | 91,8% |
|
Lühikeste fragmentide protsent <150 aluspaari (arv) |
8,6% (9,846,035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Inimese genoomis joondatud fragmentide protsent (arv) |
2,03% (2 345 084) |
9,65% (2 264 551) |
| Inimese genoomis joondatud fragmentide protsent, kui lühike on <150 aluspaari | 23,8% | 25,6% |
Inimese referentsgenoomiga sarnase DNA saamine
Saadud oletatav iidne DNA kaardistati inimese võrdlusgenoomiks, kasutades standardset genoomivariantide otsingutorustikku, kasutades BWA, samtooole ja Wcftools.
Lisaks kaardistati tänapäeva inimeste võrdlusgenoomi edukalt ainult 23,8% proovist M ja 25,6%. Lisaks ei olnud mõlema proovi korral 75% järjestatud lugemistest inimese genoomi kaardistatud. See on seletatav nii saastumisega kui ka asjaoluga, et need proovid asuvad tänapäeva inimeste genoomist piisavalt kaugel. Samal ajal tasub meeles pidada, et oleme eksoomi raamatukogu järjestanud ja seeläbi minimeerinud bakteriaalse DNA saastumise.
Keetmata lugemiste esialgne tutvumisanalüüs näitas, et mõned neist kuulusid kabiloomadele spetsiifilisele korduvale DNA-le, seda saab seletada asjaoluga, et mumifitseerimisel kasutati laamarasva.
Üksikasjalikumaks analüüsiks on vaja umbes kolm nädalat arvutusi, kuna olemasolevad lahendused tehakse ainult viiruse ja bakteri genoomide jaoks ning selleks, et mõista, millised liigid sekveneeriti, peame võrdlema kõigi olemasolevate genoomidega, sealhulgas taimegenoomidega.
Leitud võimaluste omadused
Kaardistatud lugemisi kasutati variantide otsimiseks, mis eristaksid M- ja W-proove tänapäeva inimese genoomist, samuti selleks, et hinnata lugemite saastumist inimese Y-kromosoomist.
Esimene küsimus, millele oli vaja vastata, oli, millistesse kromosoomidesse järjestatud loendid kaardistati.
Kuna me teame, et Maria proovid olid luudest ja lihastest eraldatud ning Vavita ainult luudest, eeldasime mtDNA koguse erinevust. Kuid suurt vahet polnud.
Y-le kaardistatud lugemiste arv on veel üks kaasaegsete inimeste saastumise katse. Huvitaval kombel osutus see mõlemas proovis samaks.
Leitud variantide statistika on esitatud allpool:
| Parameetrid | Näide M (Maria) | Proov W (Wawita) |
| Leitud valikute arv | 79957 | 48941 |
| Valikute arv Y-l | 534 | 541 |
| Usaldusväärsete võimaluste arv (rohkem kui 20 lugemist ja üle 30 kvaliteediga) | 16969 | 6181 |
| Variandid teadaoleva rsidiga (saadaval snip-andmebaasis) | 5701 | 3089 |
| Üldised kehtivad valikud | 92 | |
| ühised võimalused rsidiga | 49 |
Pärast seda sai võimalikuks vastata küsimusele: kas M ja W on sugulased? Vastus on eitav.
M ja W vahel leiti vaid 49 sobivat varianti ja 3040 erinevad tuntud rsid-i variantide korral. Pealegi on need võib-olla inimese või tundmatu olendi erinevad tüübid või alamliigid.
Huvitav on see, et Y-kromosoomi variandid on mõlema proovi puhul identsed, mis näitab nakatumist ühe ja sama inimese poolt ning Y-kromosoomi iidses DNA-s pole kromosoomi tõenäoliselt veel olemas.
Hinnatakse sarnasust olemasolevate järjestatud inimese genoomidega projektist 1000 inimese genoom
Pange tähele, et see on ainult ligikaudne analüüs, kuna täpsema analüüsi jaoks on vaja variante genoomi piirkondadest neutraalse valiku all ja meil on olemas eksome andmed.
Sellegipoolest, kasutades 5708 varianti M või 3096 S jaoks, oli võimalik analüüsi variant viia läbi, võrreldes 1000 inimese genoomi andmetega.
Alloleval pildil oleva PCA analüüsi tulemuseks on kahe pildi katvus M ja W jaoks, arvutatuna eraldi, kuna M ja W vahel on liiga vähe ühiseid võimalusi, et hinnata M ja W vahemaad.
Sarnasuse skoor.
Nagu näete, pole juhus ühegi geenirühmaga, need erinevad ka üksteisest. Kuid tuleb meeles pidada, et me kasutasime valiku all kodeerivaid järjestusi ja neutraalse valiku korral on soovitatav kasutada variante.
Sellegipoolest on PCA tulemus hästi kooskõlas variantide käsitsi kontrollimisega, mis näitas, et andmed asuvad viiteta homosügoteesis, mis näitab taas, et pildid on tänapäevase inimese genoomist kaugel.
Järeldus
Kahjuks piirdusime ainult kahe prooviga, tavaliselt kasutatakse seda tüüpi analüüsis rohkem, vähemalt 3-10 vähemalt kuidagi omavahel seotud. Seetõttu on vaja uurimist jätkata suure hulga proovidega.
Samal ajal võime suure tõenäosusega järeldada, et Maarja ja Vavita DNA proovid vastavad inimese DNA-le, kuid ei kattu DNA-ga, mis on meile kättesaadav 1000 inimese andmebaasist.
Raporti autorid: Baranov V. S. ja Aseev M. V. (Sünnitusabi ja günekoloogia teadusuuringute instituut, sünnieelse diagnostika osakond), Glotov A. S. ja Glotov O. S. (Peterburi Riiklik Ülikool), A. Komissarov (Venemaa Teaduste Akadeemia tsütoloogia instituut, geneetilise bioinformaatika keskus).
Materjalid, mille esitasid Konstantin Georgievich Korotkov (tehnikateaduste doktor, infotehnoloogia ülikooli mehaanika ja optika professor) ja Dmitri Vladislavovitš Galetsky (arstiteaduste kandidaat, I. P. Pavlov Peterburi Riiklik Meditsiiniülikool).
Nazca muumiate kohta leiate lisateavet sildilt: Nazca muumiad.
