Geenitehnoloogia avab inimkonnale võimalusi varem olematute organismide loomiseks ja geneetiliste haiguste hävitamiseks. Asjad pole siiski nii roosilised, sest isegi läbimurre CRISPR / Cas9 tehnoloogia pole kaugeltki täiuslik. Tema tehtud vigu võib olla harva, kuid ühest piisab, et inimesele saatuslikuks saada. Lenta.ru räägib, mis CRISPR-il viga on ja kuidas teadlased olukorda parandada üritavad.
CRISPR / Cas9 süsteemi - omamoodi DNA käärid - peetakse õigustatult revolutsiooniks geenitehnoloogia valdkonnas. Selle abiga saavad teadlased redigeerida inimese genoomi, eemaldades sellest kahjulikud mutatsioonid, ning seeläbi ravida ebameeldivaid ja surmavaid pärilikke haigusi. Ei tohiks siiski arvata, et selliseid meetodeid varem ei olnud. Geneetikute arsenalis leidus näiteks tsinki "sõrmi" sisaldavaid nukleaase ja endonukleaase - ensüüme, mis lõhustavad DNA molekule kindlates kohtades. Täpsuse, mitmekülgsuse ja kulude osas jäävad need märgatavalt alla CRISPR / Cas9-le, ehkki viimane pole kaugeltki täiuslik.
CRISPR / Cas9 loodi algselt mitte teadlaste, vaid looduse poolt. See on bakterite sees asuv molekulaarne mehhanism, mis võimaldab neil võidelda bakteriofaagide ja teiste parasiitidega. Tegelikult toimib see immuunsusena nakkuste vastu. CRISPR (tähistab "lühikesi palindroomseid kordusi, mis paiknevad regulaarselt rühmade kaupa") on DNA eripiirkonnad (lookused). Need sisaldavad lühikesi fragmente DNA viirustest, mis kunagi nakatasid tänapäevaste bakterite esivanemaid, kuid said nende sisemise kaitse abil võitu. Neid tükke nimetatakse vahetükkideks ja need eraldatakse üksteisest korduvate järjestuste abil.
Kui bakteriofaag tungib bakterisse, kasutatakse iga korduvat järjestust ja külgnevat vahetükki matriitsina molekulide sünteesiks, mida nimetatakse crRNA-deks. Moodustub palju erinevaid RNA-ahelaid, need seonduvad Cas9 valguga, mille ülesanne on äärmiselt lihtne: lõigata viiruse DNA. Kuid ta saab seda teha alles pärast seda, kui crRNA leiab viiruse DNA täiendava fragmendi. Pärast seda, kui Cas9 lõhustab võõra nukleiinhappe, hävitatakse viimane täielikult teiste nukleaaside poolt.
CRISPR / Cas9 on hea just oma täpsuse poolest, sest bakterite jaoks on immuunsüsteemi korrektne toimimine elu ja surma küsimus. "Viirusetõrje" süsteem peab leidma osa viiruse DNA-st miljoni muu hulgas ja mis kõige tähtsam, mitte segi ajama seda omaenda genoomiga. Miljonite aastate jooksul on bakterid selle mehhanismi täiustanud. Nii et kohe pärast seda, kui nad said aru, miks CRISPR-süsteemi vaja on, mõistsid nad, et seda saab taltsutada enneolematult täpse geenitöötlusvahendina.
Ühe konkreetse piirkonna asendamiseks genoomis on vaja sünteesida juht-RNA, mis on põhimõtteliselt sarnane crRNA-ga. See ütleb Cas9-le, kus modifitseeritud organismi DNA-s on vaja teha kaheahelaline paus. Kuid me ei pea geeni rikkuma, vaid seda modifitseerima - näiteks asendama ühe või mitu nukleotiidi ja eemaldama kahjuliku mutatsiooni. Siin tuleb loodus taas appi. Looduslikud parandusmehhanismid hakkavad kohe lõikeketti taastama. Trikk seisneb selles, et selleks eemaldatakse murrangu lähedal mõned RNA fragmendid, misjärel sisestatakse sinna sarnased järjestused. Teadlased saavad need oma DNA järjestustega asendada ja seega genoomi modifitseerida.
CRISPRi skemaatiline esitus
Reklaamvideo:
Pilt: Kaidor / Vikipeedia
Kuid miski pole täiuslik. Vaatamata suhtelisele täpsusele teevad CRISPR-süsteemid mõnikord vigu. Üks põhjus peitub süsteemi olemuses. Bakterite jaoks on ebasoodne, kui crRNA langeb 100 protsenti kokku viiruse DNA fragmendiga, mis võib erineda ühe või kahe nukleotiidi poolest. Tema jaoks on parem, et mõned nukleotiidid võivad olla erinevad, mis annab mikroorganismile parema võimaluse nakkusega võidelda. Samal ajal ähvardab geenitehnoloogias madal spetsiifilisus vigu: muudatusi saab teha vales kohas. Kui see juhtub hiirtega tehtud katsete käigus, siis erilist tragöödiat ei toimu, kuid inimese genoomi muutmine võib kujuneda katastroofiks.
See seletab Lääne teadlaste muret Hiinas tehtavate katsete pärast. Aasia teadlased on inimese embrüote geneetiliseks muutmiseks kasutanud CRISPR-tehnoloogiat. Sellised katsed on Euroopas ja Ameerika Ühendriikides keelatud, kuid hiljuti lubas Ühendkuningriik neid - ainult teadusuuringute eesmärgil. Sellised embrüod tuleb hävitada paari nädala jooksul pärast vastuvõtmist, mis välistab GM-de inimeste "aretamise".
Kuid CRISPR / Cas9 poleks nii suurepärane, kui seda ei saaks paremaks muuta. Niisiis õpetasid teadlased Cas9 lõikama mitte kahte ahelat korraga, vaid ainult ühte. Lõige tehakse DNA järjestuse kahes erinevas kohas erinevatel ahelatel, nii et süsteem peab suutma tavalisest kaks korda rohkem nukleotiide ära tunda, muutes selle täpsemaks.
Valk Cas ja crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Lääne-Ontario ülikooli teadlased on leidnud veel ühe viisi selle tehnoloogia täiustamiseks. Nad üritasid lahendada lõigatud DNA parandamise probleemi. Nukleiinhappeahela kiire taastamine toob kaasa asjaolu, et teadlastel pole aega genoomi ise korrigeerida. Seega luuakse nõiaring: soovimatul viisil parandatud ahel tuleb uuesti lõigata Cas9 valguga.
Selle vältimiseks muutsid teadlased valgukäärid, et luua valk TevCas9. See lõikab DNA ahela kahest kohast, muutes saidi parandamise keeruliseks. Uue ensüümi sünteesimiseks lisati Cas 9-le ensüüm I-Tevl, mis on samuti endonukleaas, see tähendab valk, mis lõhestab DNA molekuli keskelt, mitte ei lõhu järjestuse otsad, nagu eksonukleaasid teevad. Saadud sulandvalk osutus täpsematesse kohtadesse seondumisel täpsemaks ning vähem viga ja valet saiti lõikama.
DNA-ga seotud Cas9 kristallstruktuur
Foto: Cas9 wiki projekt / Vikipeedia
CRISPR-süsteemide täpsuse parandamiseks on veel üks viis. Bakterite ja viiruste vaheline "võidurelvastumine" on viinud mitte ainult mikroorganismide kaitsesüsteemide arenguni, vaid ka nende neutraliseerimise viisideni. Seega muteeruvad bakteriofaagid kiiresti, kaotades alad, mille järgi bakterite immuunsus neid ära tunneb. Kuid mõned kodeerivad CRISPR-vastaseid valke, häirides crRNA-Cas9 kompleksi tööd.
8. detsembril avaldas ajakiri Cell Toronto ülikooli teadlaste artikli, mis lõi "anti-CRISPRi" - süsteemi, mis võimaldab teatud tingimustel mehhanismi välja lülitada. See hoiab ära soovimatud vead, pärssides Cas9 aktiivsust juhul, kui juht-RNA seondub vale fragmendiga. Anti-CRISPR koosneb kolmest valgust, mis pärsivad nukleaasi ja mida kodeerivad ühe bakteriviiruse geenid.
Juba praegu kasutatakse CRISPR-tehnoloogiat selliste raskete haiguste nagu leukeemia ja kopsuvähk raviks ning seda testitakse ka HIV-i puhastamiseks immuunrakkudest. Kui teadlased leiavad uusi meetodeid selle meetodi täiustamiseks, avaneb üha rohkem võimalusi selle rakendamiseks.
Aleksander Enikeev
