Optogeneetika on erutuvate rakkude uurimise meetod, mis kasutab rakumembraani kinnistunud ja valguse poolt aktiveeritavaid valke (seega "opto"). Selliseid valke (opsiinid) leidub enamikul loomadest silma võrkkestas, aga ka mõnedes taimedes, näiteks rohevetikates. Fotoaktiveeritud valkude integreerimiseks neuronaalsetesse membraanidesse on vaja neuronitesse viia teistest organismidest saadud rodopsiini geenid, seega "geneetika". 2015. aastal tähistas optogeneetika oma kümnendat aastapäeva. Selle aja jooksul on tõhus vahend närvisüsteemi uurimiseks muutunud tugevamaks ja see on saanud mitmeid rakendusi, mis olid algselt kättesaamatud.
Aju ja selle elemendid
Teadvus, isiksus, intelligentsus - kõik see on loodud neuronite poolt. See tähendab, et kui tahame uurida inimese (ja mitte ainult) olemuse neid aspekte, peame kindlasti aru saama, mis toimub uuritava objekti närvirakkudega. Põhiprobleem on see, et neid närvirakke on liiga palju ja kõiki neuroneid korraga on võimatu jälgida. Lisaks kipuvad närvirakud moodustama kobaraid, seega on problemaatiline eraldada ühe neuroni tegevus teisest ja tegutseda enamikul juhtudel igal rakul eraldi. Sellel on kaks võimalust: aktsepteerida ja registreerida rakurühmade aktiivsus, saada omamoodi "keskmine temperatuur haiglas" või proovida võimaluse korral ikkagi uurida ühte neuroni - väga vajalik ja keha jaoks oluline. Esimest kasutatakse sagedamini imetajate aju uuringutes,teine - lihtsate närvisüsteemide puhul (näiteks jälgivad nad sarnaste omadustega viinamarja tigu või meritigude alysia rakkude kaitsekäitumise suurte "käsu neuronite" elektrilist aktiivsust). Oma suhteliselt väikese närvisüsteemiga molluskid, ussid ja puuviljakärbsed on muidugi head, kuid nad on inimestest väga kaugel. Tahaksin uurida kedagi, kelle aju on meie struktuurile lähemal, ja seetõttu valime sagedamini esimese lähenemisviisi.kelle aju on struktuurilt lähemal meie omadele ja seetõttu valitakse sagedamini esimene lähenemisviis.kelle aju on struktuurilt lähemal meie omadele ja seetõttu valitakse sagedamini esimene lähenemisviis.
Närvisüsteemi uurimiseks on palju meetodeid, kuid need pole peaaegu alati väga täpsed. Seal on funktsionaalne magnetresonantstomograafia, mis ei võimalda näha üksikuid rakke ja tunneb ära ainult suhteliselt aeglased protsessid (muutused ajuveresoonte verevarustuses). On olemas elektroentsefalograafia, see on kiirem, kuid see ei erista ka üksikuid neuroneid ja sarnaneb sellega, et proovitakse midagi loetavat lindistada, riputades keset matši mikrofoni jalgpalliväljaku kohale. Lõpuks võib kasutada fluorestsentsvärve, mis muudavad värvi vastuseks teatud ioonide kontsentratsiooni muutustele rakus või nende kogulaengule (st neuroni membraanipotentsiaalile). Need värvained toimivad üsna aeglaselt. Nende ajaline eraldusvõime (reageerimisaeg) ei ole piisavalt kõrge, et tuvastada ja "näidata" neuronis eraldi toimimispotentsiaali. Täpsemalt,seda kaaluti kuni hiljuti avaldatud väljaandeni, mille autorid suutsid seda veel teha (Science, 2015, 350, 6266: 1361–1366, doi: 10.1126 / science.aab0810).
Ühesõnaga, ühe raku aktiivsust pole nii lihtne registreerida, mõjutamata naaberneuroneid. Seda tegevust on veelgi raskem konkreetselt modifitseerida. Ajusse saate süstida farmakoloogilisi ravimeid, mis toimivad ainult teatud omadustega rakkudele, seejärel vaadata neid rakke mikroskoobi all või lõigata osa looma ajust ja registreerida selle elektriline aktiivsus mikroelektroodidega. Kuid sellise ravimi saamiseks tuleb loom tappa. Isegi kui jätta kõrvale loomade kahju ja inimlikkuse kaalutlused, tuleb tunnistada, et sellised katsed on äärmiselt raiskavad. Selleks, et teada saada, kuidas väikese arvu rakkude signaalid on muutunud, peate kasvatama terve aju, söötma seda ja hoolitsema selle eest ning pärast preparaadi ettevalmistamist saab seda kasutada poolteist tundi, harvemini kauem.
Teine võimalus on stimuleerida üksikuid neuroneid tehislike elektriliste signaalidega, juhtides neid signaale mööda vastavat närvi või joota rakke neurotransmitteritega kunstliku sünapsi mudeli raames. Kuid selleks peate kõigepealt leidma sobivad lahtrid ja see ei ole tühine ülesanne.
Lõpuks on olemas meetod glutamaadi kunstlikuks vabastamiseks sünaptilistest vesiikulitest ultraviolettkiirguse mõjul (seda meetodit nimetatakse ka glutamaadi lahtipakkimiseks). Tegelikult jäljendab valgus sel juhul rakusse saabuva erutussignaali toimimist, käivitades sünapsi ajal neurotransmitteri vabastamise. See on väga täpne ja tõhus vahend, kuid sellel on ka puudus. Ultraviolettkiirguse toimel suudavad nad nüüd vabastada ainult glutamaati, kuid mitte kõik neuronid ei erita seda ja mitte mõni muu signaalikandja. Lisaks ei aktiveeri glutamaadi kunstlik vabanemine sihtmärgiks olevat neuroni sama tugevalt kui elektriline stimulatsioon piki närvi ning sellisel juhul on problemaatiline teha raku väljundi aktsioonipotentsiaalid.
Reklaamvideo:
Vetikatest neuroniteni
Alates 2005. aastast on neuraktiivsuse peen manipuleerimine muutunud võimalikuks ja sellele on aidanud kaasa fotoaktiveeritud ained, mis suudavad valguskvante hõivata ja neile reageerida. Mõnda neist on tuntud juba pikka aega, alates 1970. aastate algusest, kuid neurobioloogilistes uuringutes õpiti neid kasutama alles 2000. aastate keskel.
Üherakulistel vetikatel Chlamydomonas reinhardtii on valk nimega chanelrodopsin-2 (ChR2). Nimes on selge, et see on võrkkesta varraste rodopsiini sugulane. Nagu silmapigment, reageerib ka chanelrodopsin kergele kiiritamisele vaid pisut erineval viisil: see suurendab positiivsete ioonide sissevoolu vetikarakku. See mõjutab selle membraanipotentsiaali (puhkepotentsiaali): sekundi sekundites läheneb see tahtlikult negatiivsest nullist; eksperdid ütlevad: "rakk on depolariseeritud." Sel juhul ei tekita Chlamydomonase rakk aktsioonipotentsiaali, kuid see oleks teoreetiliselt võimalik: aktsioonipotentsiaalidega sarnased elektrisignaalid võivad tekkida ka taimerakkudes (Plant, Cell and Environment, 2007, 30, 249–257, doi: 10.1111 / j.). 1365-3040.2006.01614.x).
Kui Chanelrodopsin-2 geen Chlamydomonasest eraldati ja klooniti, sai selle nukleotiidijärjestus teada mitmele uurimisrühmale, sealhulgas Karl Deisserothi laborile Stanfordi ülikoolis. See sündmus osutus optogeneetika sünnil otsustavaks. Sel ajal, kui teised meeskonnad hakkasid aktiivselt kanalite mitmekesisust uurima, märkasid selle labori juhataja, neurofüsioloog ja ka psühhiaater (tõenäoliselt mängisid uuritava objekti valimisel olulist rolli arst Deisserothi praktiline mõtlemine) ChR2-s midagi sellist, mida võiks rakendada. Kuna meil on valk, mis on võimeline muutma raku membraanipotentsiaali, ja meil on selle geen, siis miks mitte sisestada see geen elektriliselt erutatavasse rakku ja vaadata, mis juhtub?
Pole varem öelnud kui teinud. Chanelrodopsin-2 geen kinnitati promootori külge (DNA järjestus, mis näitab RNA polümeraasile, et molekuli järgmine osa tuleks lugeda ja teha selle mRNA proovist), sisestati viirusesse ja viirus ise süstiti peene nõelaga hiire aju. Peame lihtsalt kontrollima, kuhu täpselt viiruseosakesed sattusid, kas jätsime süstekoha vahele. Selle mõistmiseks on lisaks valgustundliku valgu geenile vaja neuronisse viia ka reportermaterjali geen - see aine näitab chanelrodopsiini olemasolu. Mugav reporter on fluorestsentsvalk, kuna rakkude fluorestsents on nähtav nii aju lõikudel kui ka - piisava kontsentratsiooniga - ka väljaspool keha. ChR2 geen ja reportergeen (näiteks kollane fluorestsentsvalk YFP) asuvad sama promootori all, seega ekspresseeritakse neid koos,ja mõlemad valgud toodetakse rakus samal ajal. Kui rakus on chanelrodopsiini, fluorestseerub.
Peaaegu kõik on valmis, jääb üle vaid ehitada ajusse valgusallikas, mis aktiveerib Chanelrodopsiini kandvad rakud. See allikas on tavaliselt miniatuurne fiiberoptiline LED, mis tekitab valgust lainepikkusega umbes 480 nm (sinine). Just sellele kiirgusele reageerib ChR2 kõige tõhusamalt. Kiud sisestatakse aju soovitud piirkonda ja fikseeritakse kolju pinnale spetsiaalse kanüüliga (joonis 1). Loom võib sellist seadet kanda väga pikka aega ja oma rakkude aktiivsuse registreerimiseks ei pea teda tapma. Ja see on hea nii eetika kui ka praktika seisukohast. Optogeneetilise katse ajal võib eksperimentaalne olend vabalt liikuda ja tema käitumine on kindlasti looduslähedasem kui siis, kui samu neuroneid uuritaks ajuosades või loomal.fikseeritakse anesteesia all stereotaksis.
Joonis: 1. Fotoaktiveeritud kanali neuronitesse viimise üldskeem.
Valgusallikast üksi täieliku katse läbiviimiseks ei piisa. Me ei saa öelda, kuidas "eksperimentaalsed" neuronid fotostimulatsioonile reageerisid, kuni me pole kinnitanud elektriliste signaalide ilmnemist vastusena valgusele. Seetõttu on paralleelselt neuroni aktiveerimise instrumendiga vaja ka vahendit selle aktiivsuse registreerimiseks, nii et mikroelektroodid implanteeritakse koos valgusallikaga ajju. Tegelikult kinnitasid Deisserot ja tema kolleegid nende mikroelektroodide kasutamisel praktikas, et chanelrodopsiini abil on võimalik raku membraanipotentsiaali tugevalt ja kiiresti muuta kuni aktsioonipotentsiaalide genereerimiseni, ning kirjeldasid tulemusi artiklis (Nature Neuroscience, 2005, 8, 1263-1268, doi: 10.1038 / nn1525). Selle tööga algas optogeneetika ajastu.
Lülitid, lülitid ja muud
Channelrodopsin pole ainus fotoaktiveeritud kanal optogeneetika teenistuses. Samuti on olemas halorhodopsiin (HR, joonis 2), arheoloogiline valk, mis kollase tulega aktiveerituna laseb sisse negatiivselt laetud kloori ioone (ja mitte positiivseid naatriumi- ja kaaliumiioone, nagu kannelrodopsiini puhul). See viib rakumembraani hüperpolariseerumiseni: potentsiaalide erinevus sellel muutub negatiivsemaks kui puhkeolekus ja rakk, mis varem andis kergesti aktsioonipotentsiaalid, "vaigistab", kui halorhodopsiin aktiveeritakse.
Joonis: 2. Halorhodopsiini töö skeem. Kui see kanal on aktiivne, on lahtril keerulisem aktsioonipotentsiaali genereerida.
Halorhodopsiini ja chanelrodopsiini geenid saab sisestada samasse rakku või neid saab viia erinevatesse. Kaks fotoaktiveeritud kanalit, millel on erinevad omadused, on paremad kui üks. Kuid see pole veel kõik (joonis 3). Samuti on bakterihododsiini (BR) ja protorhodopsiini (PR). Nagu kanalrodopsiin, avavad nad aktiveerumisel tee positiivselt laetud ioonidele, kuid mitte ühegi, vaid ainult vesinikuioonide - prootonite jaoks. Ja efekt on chanelrodopsiini vastand: prootonid ei sisene raku, vaid jätavad selle, mille tõttu membraan hüperpolariseerub ja raku erutusvõime kaob.
Joonis: 3. Optogeneetikas kasutatavad fotoaktiveeritud kanalite sordid.
Leidub ka eksootilisi loomaopsiine üldnimega Opto-XR. Need ei ole ioonikanalid, vaid imetajate võrkkesta koonuste rodopsiini hübriidid ja mõned G-valkudega ühendatud retseptorid (G-valgud kasutavad nukleotiidi GDP muundamist GTP-ks ja käivitavad rakkudes palju signaalimisprotsesse). Täpsemalt, Opto-XR seeria kannab adrenergiliste retseptorite fragmente ja üks ebatavaline liik koosneb osast roti rodopsiinist ja osast serotoniini tüüp 1A retseptorist. Muidugi, ilma kanaliteta, ei saa Opto-XR aktsioonipotentsiaali pakkuda, kuid nende aktiveerimine jäljendab retseptorite aktiveerimist, mille osi nad ise kannavad. Teisisõnu, pärast Rh-CT (5-HT1A) kokkupuudet toimib rakk nii, nagu oleks serotoniin jõudnud oma sünapsitesse. On tõestatud, et sellised hübriidvalgud asuvad neuronaalsetel membraanidel umbes samas kohas,kus on sarnaste neurotransmitterite tõelised retseptorid. Seetõttu saab neid kasutada mitmesuguste aju signaaliedastussüsteemide uurimiseks, kartmata saada tegelikkusest kaugel asuvaid tulemusi.
Hiljuti kirjeldasid Texase ülikooli meditsiinikooli teadlased tervet hulka uusi vetikaid sisaldavaid rodopsiine, mis juhivad rakkudesse negatiivselt laetud ioone. Need reageerivad fotostimulatsioonile kiiremini kui juba optogeneetikas kasutatavad rodopsiinid ja vajavad aktiveerimiseks vähem valgust (Science, 2015, 349, 6248, 647-650, doi: 10.1126 / science. Aaa7484). Võib-olla on neil suur tulevik.
Optogeneetika ja käitumine
Kuid piisavalt neurofüsioloogilist teooriat on aeg edasi liikuda praktikale. Käitumine sõltub närvisignaalide jadadest, mis ilmuvad õigel ajal õiges kohas. Selgub, et teades nende signaalide aega, kohta ja järjestust, saame luua soovitud käitumisvormi ja saada puuduvat teavet struktuuride kohta, mille kaudu selline käitumine avaldub.
Selle teema huvitav uurimus avaldati hiljuti ajakirjas Nature (2015, 519, 233–236, doi: 10.1038 / loodus14024). Ehkki optogeneetilisi tehnikaid katsetati algselt närilistega, ei keela miski seda teha ka teiste mudeliobjektide, näiteks Drosophila puhul. Muidugi nõuab see tehnika pisut muutmist, sest putukate neurofüsioloogia erineb imetajate neurofüsioloogiast.
Drosophilat, nagu inimesi, mõjutab pikaajaline viibimine omasugustesse lähedastesse klastritesse, teisisõnu rahvamassi. Teisisõnu, nad on ka karja all. On teada, et puuviljakärbeste süsinikdioksiidil on väga ebameeldiv lõhn. CO2 lõhnav üksik kärbes lendab aeglaselt värske õhu kätte. Kui see putukas oli karjas, taanduvad teised selle taga kiiresti. Isegi kui saja kärbse seas on haistmist vaid pooled ja ülejäänud on haisu tõkestatud, liigub kogu sada haisu allikast eemale. Kummalisel kombel seda sünkroonsust ei saavutata haistmismeele kaudu. Vältimisreaktsioon on sel juhul kollektiivse iseloomuga: mõned kärbsed saadavad teistele signaale vajaduse kohta liikuda süsihappegaasi allikast eemale. Putukad edastavad põgenemiskõne üksteist puudutades. Lisaks kärbestessignaali vastuvõtmisel aktiveeritakse jalgade tipus olevad mehaanilised sensoorsed neuronid. Selle tõestamiseks kasutati mitmeid meetodeid, sealhulgas optogeneetikat. Täpsemalt, ühes katses aktiveeriti rakkudesse manustatud ChR2-ga käppade otste mehaanilised sensoorsed neuronid optigeneetiliselt normaalse (mitte nende jaoks ülemäärase) CO2 sisaldusega atmosfääri kärbestes ja putukad näitasid vältimisreaktsiooni, justkui oleks nende kõrval tugev süsihappegaasi lõhn. gaas.ja putukatel oli vältimisvastus, justkui oleks nende ümber tugev süsihappegaasi lõhn.ja putukatel oli vältimisvastus, justkui oleks nende ümber tugev süsihappegaasi lõhn.
Muu hulgas saab fotoaktiveerimise abil neuronitesse viia teavet, mida nad tegelikkuses ei saanud. Lihtsamalt öeldes võimaldab optogeneetika luua võltsmälestusi. Seda tõestas 2013. aastal MIT-i Susumu Tonegawa meeskond, kasutades näitena hiirt (Science, 2013, 341, 6144, 387–391, doi: 10.1126 / science.1239073). Teadlased süstisid kanalrodopsiini-2 neuronitesse hipokampuse kahes piirkonnas, mis vastutasid teabe tõlkimise eest lühiajalisest mälust pikaajalisse mällu - dentate gyrus ja CA1 väli. Chanelrodopsiiniga märgistati ainult neid rakke, mis elektrilise aktiivsuse registreerimise eelkatsetes olid elevil, kui looma hirmutas heli ja elektrilöök teatud "dekoratsioonides" (nad ütlevad ka - teatud kontekstis). See tähendab, et algselt loom jäi meeldeet heli tasub karta ühes seade, kuid mitte tingimata teises. Pärast seda aktiveeriti kanaliseeritud kopsiiniga neuronid spetsiaalselt siis, kui loom oli muus "maastikus" ja teoreetiliselt ei tohtinud see hirmu näidata. Selle protseduuri ajal aga hiired uues keskkonnas (kus neid elektrilööki ei tehtud) külmusid kohale, peitsid nurka või lömasid.
Kuna selgus, et see toodi pähe, mida loom kunagi ei mäletanud, siis on kindlasti võimalik kadunud teave tagastada. Seda tegid sama labori töötajad kaks aastat hiljem (Science, 2015, 348, 6238, 1007-1013, doi: 10.1126 / science.aaa5542). Esiteks õpetasid nad närilistele teatud oskusi, seejärel süstisid nad ajju proteiinisünteesi inhibiitoritega, mis segavad hiljuti õpitud mäletamist (see on tõestatud paljudes varasemates töödes). Unustatud mälu võiks aga tuua tagasi hipokampuse teatud rakkude optogeneetiliselt aktiveerimisega. Arvasime välja, millised neuronid tuleb aktiveerida umbes samal viisil kui eelmises töös.
Optogeneetika ja uni
Optogeneetika on aidanud ka une uurimisel. Oli teada, et hüpotalamuse külgmistes piirkondades on neuroneid, mis sekreteerivad ainet oreksiin ehk aka hüpokretiin. Stabiilne ärkvelolek on hüpotalamuses vähendatud hüpokretiinisisalduse korral võimatu. Kui seda sekreteerivad rakud pole piisavalt aktiivsed, areneb loomal (ja ka inimesel) narkolepsia - ärkveloleku ajal tekivad unes äkilised rünnakud. Patsient kas täielikult magab või tal on mõni unehäire, näiteks lihastoonuse järsk langus või teadvusekaotus. Narkoleptilisi krampe ei saa kontrollida ja need võivad juhtuda kõige ebasobivamal hetkel - näiteks kui inimene sõidab.
Kuid see võib olla ka kokkusattumus ja ilma täiendavate eksperimentideta ei saaks väita, et ärkvelolekut toetavad just oreksiini neuronid. Nende aktiveerimise ajal oli vaja kontrollida, mis juhtub magama jäämisega. Karl Deisseroti laboratooriumi teadlased lisasid chanelrodopsin-2 hiirte hüpotalamuse hüpokretiinneuronitesse ja stimuleerisid seejärel näriliste ajusid perioodiliselt nende magamise ajal valgusega (Nature, 2007, 450, 420-424, doi: 10.1038 / nature06310). Hiired ärkasid sellest mõjust nii aeglase laine magamise kui ka kiire laine magamise etapis. Samal ajal aktiveeriti oreksiini neuronid erineva tugevusega, sõltuvalt sellest, kui sageli nad särasid. Kõik see kokku annab õiguse väita, et oreksiini (hüpokretiin) eraldumine piisavas koguses tagab tõepoolest ärkveloleku säilimise.
Optogeneetika ja süda
Optogeneetikat ei pea rakendama ainult neuronitele, see sobib kõigile rakkudele, mida elektriliste signaalide abil erutada saab. Lisaks neuronitele on loomadel need lihasrakud, sealhulgas südamelihas. Kardiomüotsüüdid tuleb ergastada sünkroonselt, see tagab nende üheaegse kokkutõmbumise. Roti kutsikate, inimeste ja koerte südamerakkude optogeneetilise aktiveerimise katsed on näidanud, et sinise valgusega stimulatsioonist põhjustatud erutus- ja kontraktsioonilained ei erine nende parameetrite järgi „päris“elektrilainetest (Circulation. Arrütmia and electrophysiology, 2011, 4, 5, 753). –760, doi: 10.1161 / CIRCEP.111.964247, südame rütm, 2012, 9, 11, 1910). Neid töid elusatel objektidel ei tehtud, sellegipoolest näitavad tulemused, et haige südame tööd saab teoreetiliselt optogeneetika abil korrigeerida.
Optogeneetika ja psühhiaatria
Tõenäoliselt pole liialdus öelda, et optogeneetika meetodi rakendamine psühhiaatrias on Deisserothi üks peamisi lõppeesmärke, arvestades tema teist elukutset. Tore oleks kõigepealt õppida, kuidas aju neuronid on üksteisega ühendatud, ja seejärel stimuleerida (või pärssida) signaalide edastamist soovitud rakurühmade vahel. Ülesanne on äärmiselt aeganõudev, kuid teoreetiliselt teostatav. Optogeneetika meetodi arendajad on selles valdkonnas teinud mitmeid avastusi. Mõned neist hõlmavad dopamiini eritavaid rakke. See neurotransmitter mängib muu hulgas tohutut rolli hea tuju säilitamisel ja annab tunnustuse selle eest, mida teete (öeldakse, et dopamiini vabastavad neuronid on osa tasusüsteemist). Sellised ravimid nagu kokaiin jäljendavad dopamiini toimet neuronitele,põhjustades rahulolutunnet. Keha mäletab seda sensatsiooni ja harjub ravimiga, moodustub psühholoogiline ja füsioloogiline sõltuvus.
Tuuma akumulatsioon on osa aju premeerimissüsteemist. Kui selle rakke, mis sekreteerivad dopamiini, tarnitakse halorodüpsiiniga ja neid seejärel valgusega stimuleeritakse, lülitatakse tuumaaktiivid välja ja samal ajal kaob ajutiselt eksperimentaalsete rottide iha kokaiini järele (Nature, 2014, 505, 309-317, doi: 10.1038 / loodus12982). Sarnaseid manipuleerimisi oleks võimalik teha ka narkomaanidel, kuid selleks on vaja muuta nende neuronite genoomi, mida veel teha pole lubatud.
Piisav dopamiin kaitseb mõnede depressioonivormide ja Parkinsoni tõve eest. Ja kui optogeneetika panus parkinsonismi uurimisel pole endiselt väga suur, siis on näriliste depressiivset käitumist õnnestunud fotoaktiveeritud kanalite abil edukalt kõrvaldada (Nature, 2013, 493, 7433, 537-541, doi: 10.1038 / loodus11740).
Nii et teoreetiliselt võib optogeneetika heita valgust kõigile erutuvate rakkudega seotud patoloogilistele seisunditele. See pole ainult narkomaania ja narkolepsia, depressioon ja Parkinsoni tõbi, vaid ka skisofreenia, südameatakid, ärevus, stressihäired ja palju muud. Siiani on võime neid haigusi fotoaktiveeritud kanalitega ravida tehnoloogia ja moraali küsimustes. Siiski on võimalik, et 20–30 aasta pärast piiravad optogeneetika potentsiaali üksnes teadusuuringuid kontrollivate teadlaste ja ametnike eetilised põhimõtted.
Svetlana Yastrebova
